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蛋白質(zhì)純化注意事項(xiàng)

更新時(shí)間:2021-12-20 點(diǎn)擊次數(shù):3475

在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中,需注意幾個(gè)問(wèn)題。首先,提純過(guò)程中始終要控制pH值,盡量避免由于過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化。緩沖液要有合適的pH值,又要對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)害,在提純植物和菌類(lèi)中的蛋白質(zhì)時(shí),通常需要較大的緩沖容量,此時(shí)要注意緩沖液的濃度,同時(shí)還要注意緩沖液組分是否合適,會(huì)不會(huì)產(chǎn)生副反應(yīng)等。含巰基的蛋白質(zhì)(其中的巰基未結(jié)合成二硫鍵時(shí))特別容易被氧化,因此,要維持一個(gè)還原環(huán)境??杉尤胍恍┖袔€基的還原劑,并使整個(gè)體系保持無(wú)氧狀態(tài),以解決此問(wèn)題,但在有些情況下,加入的巰基化合物可能會(huì)抑制蛋白質(zhì)的活力。


提純過(guò)程中,通常要保持低溫,因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)有蛋白水解酶存在,這種酶在組織勻化后處于活化狀態(tài),能降解蛋白質(zhì)。因此,必須保持低溫來(lái)降低水解酶的作用。但要注意,有時(shí)低溫又能使某些酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞。一般情況下,蛋白質(zhì)在0℃時(shí)比較穩(wěn)定,但丙酮素羧化酶對(duì)冷敏感,25℃時(shí)穩(wěn)定。有些酶則需在-20℃或-70℃下穩(wěn)定活性。


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蛋白質(zhì)純化過(guò)程中一個(gè)最大的問(wèn)題是在整個(gè)純化過(guò)程中,蛋白質(zhì)或多或少地總是要受到與生理狀態(tài)極不相同的溶液環(huán)境的有害影響。這一點(diǎn)對(duì)其功能在活細(xì)胞內(nèi)受高度控制的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)是非常值得注意的。相反,有些蛋白質(zhì),如分泌蛋白質(zhì),卻能適應(yīng)較大的環(huán)境變化,而不改變其結(jié)構(gòu)和功能。為了減少蛋白質(zhì)在稀的水溶液中的自發(fā)變性,可以向蛋白質(zhì)溶液中加入一些小分子量物質(zhì)(如蔗糖、甘油等)或其他蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白、明膠等),來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì),這是仿造細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的一個(gè)方法,可以減少水的有害作用。這也是許多基因蛋白質(zhì)藥物中加入白蛋白來(lái)作為穩(wěn)定劑的原因。有時(shí)甚至加入二甲基亞砜、二甲基甲酰胺等,加入的濃度需要試驗(yàn),一般在1%-10%,少數(shù)蛋白質(zhì)可在高離子強(qiáng)度的極性介質(zhì)中保持活性,如KCl、NaCl、(NH4)2SO4等。

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此外,還有一些常用的辦法可有效地減少蛋白質(zhì)變性,如有些二價(jià)離子(Mg2+、Ca2+等)的存在有助于蛋白質(zhì)或蛋白絡(luò)合物的穩(wěn)定;提純酶時(shí),可以加入專(zhuān)一性的底物;有時(shí)候需要使用絡(luò)合劑(如乙二胺四乙酸鹽)除去不需要的離子,特別是那些由水源帶來(lái)的有害金屬離子。這些方法可視不同情況加以利用。


要注意的另一個(gè)因素是,在提純過(guò)程中即使很小心,蛋白質(zhì)也會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化。因此,提純后的蛋白質(zhì),即使其活力基本上得以保留,它的構(gòu)象也可能不同于天然構(gòu)象或完整功能的構(gòu)象。在這種情況下,在生物體外測(cè)得的蛋白質(zhì)的性質(zhì)未必能準(zhǔn)確地反映這些大分子在活體內(nèi)的性狀。

含多個(gè)亞單位蛋白質(zhì)的解離是一種特殊類(lèi)型的變性。提純蛋白質(zhì)時(shí),當(dāng)所測(cè)得的活力是僅由一種亞單位表現(xiàn)出來(lái)的時(shí)候,其他的亞單位可能會(huì)因?yàn)樽⒁獠坏蕉鴣G失。有的蛋白質(zhì)在體內(nèi)具有多功能形式,其生物活性是由兩個(gè)以上不同的遺傳基因決定的蛋白質(zhì)一起顯示出來(lái)的。那么由一個(gè)已經(jīng)純化的蛋白質(zhì)的性質(zhì)去推斷它在體內(nèi)完整的生物學(xué)功能時(shí)要特別小心。這時(shí)分析提純過(guò)程中總的活力是有益的。在提純的早期階段,如果用總活力作基準(zhǔn),在提純結(jié)束時(shí)希望能回收50%總活力,而實(shí)際所能達(dá)到的收率往往只有5%-20%。在有些情況下,特別是有大量原料可供利用的情況下,我們可專(zhuān)心致力于獲得高比活的樣品,而不必顧忌收率。


上述討論可為提純蛋白質(zhì)的基本準(zhǔn)則。

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